北京協和醫院近期發布了《新型冠狀病毒核酸檢測》標準操作流程。這為我們建設2019-nCov新型冠狀病毒P3實驗室建設提供了科學指導。
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具體檢測流程如下
一、核酸檢測前的生物安全防護（工作人員個人三級防護的穿戴）
1、穿戴流程：
在基因擴增實驗室的清潔區（更衣區）或者普通實驗室的潔凈區，工作人員按順序依次穿戴好一次性帽子、醫用N95口罩、一次性防護服、一次性鞋套、一次性防水靴套、防護目鏡和雙層乳膠手套，進入樣本處理工作區域或實驗室。
2、要點提示：
2.1、具備標準基因擴增布局條件的實驗室，應在清潔更衣區做好個人三級防護，條件有限的實驗室亦可選擇在一潔凈的實驗室中按流程穿戴好個人三級防護。
2.2、需佩戴醫用N95口罩，若無醫用N95口罩，可以考慮用普通N95/KN95口罩外加一次性外科口罩的組合方式，但不要佩戴有呼吸閥的N95口罩。
2.3、佩戴N95口罩時需檢查密閉性，通過雙手按壓、深呼吸、左右轉頭等動作嚴格檢查口罩是否佩戴正確。
2.4、一次性防護服已具備新型冠狀病毒核酸檢測的防護需求，有條件時可以考慮加穿一次性反穿隔離衣，穿衣時需由他人協助。
2.5、穿戴整齊的工作人員，應按要求盡快進入樣本處理的實驗區域開展工作，嚴禁穿戴三級防護后再進入普通實驗區域或辦公區域。
二、樣本的滅活處理
1、操作流程：
兩名完成三級防護的工作人員，進入樣本處理區或樣本處理實驗室，將接收到的樣本二級包裝在安全柜內打開，檢查樣本主容器是否為嚴格密閉；對密封袋表面進行消毒后，對送檢樣本進行56℃下30分鐘的滅活，滅活后的樣本管需在生物安全柜內打開內層的容器，將拭子保存液混勻后進行分裝和用于核酸提取。
2、要點提示：
2.1、涉及高致病性病原微生物的實驗室活動，需由兩名工作人員完成，其中一人負責主要實驗操作，一人提供必要的協助。主操作者應避免反復多次進出安全柜。
2.2、滅活形式：可以采用水浴或空氣加熱形式完成滅活，采用空氣加熱時可適當延長滅活時間。有條件時可以采用小型化設備在安全柜內操作，減少樣本進出安全柜的次數。滅活前的樣本嚴禁在生物安全柜外打開和操作。
2.3、應特別檢查采樣管是否擰緊、有無樣本溢漏等情況。
2.4、樣本管每次進出安全柜均需對外表面進行消毒。
2.5、應就近配備適量的消毒處理物品，以防止實驗操作過程中可能發生的意外溢灑事故，有條件時建議在安全柜內配備一次性吸水臺布。
三、樣本的核酸提取
1、手工核酸提取操作流程（以凱杰的52906柱提法核酸提取試劑盒為例）
1.1、裂解液配制：在基因擴增實驗室的試劑配制區或單獨的普通試劑配制實驗室中，準備核酸提取所需的洗液1（AW1）、洗液2（AW2）和carrier RNA。按照要求，分別向洗液1和洗液2中加入分子生物學級別的130ml和160ml的無水乙醇并及時做好標記；取310μl洗脫液（AVE）溶解310μg/支的Carrier RNA。配置好后，通過傳遞窗進入核酸提取區或由工作人員送入核酸提取實驗室。
1.2、樣本裂解：取560μl AVL裂解液到1、5ml無菌EP管中，加入5、6μl配制好的Carrier RNA，再加入已經滅活的140μl樣本（例如咽拭子、血漿等），混勻振蕩15秒，室溫靜置10分鐘，充分裂解樣本中的核酸。將EP管瞬時離心后加入560μl無水乙醇，充分混勻15秒，再次瞬時離心后備用。吸取630μl裂解產物，小心加入至離心柱中，8000rpm（或6000g）離心1分鐘，轉移離心柱至新收集管，將剩余630μl裂解產物加到離心柱中，重復上一離心操作（若樣本體積大于140μl，則在此步驟重復將630μl裂解產物過濾收集在一個離心柱上）。
1.3、核酸的洗滌：取500μl洗液1（AW1）至離心柱中，8000rpm（或6000g）離心1分鐘；換新收集管后，取500μl洗液2（AW2）至離心柱中，8000rpm（或6000g）離心1分鐘；換新收集管后，用14000rpm（或20000g）離心3分鐘，去除洗液2（AW2）；換新收集管后，繼續用離心機大轉速（20000g）離心1分鐘，充分甩離殘留的洗液2（AW2）。
1.4、核酸的洗脫和回收：取一1、5ml無菌EP管，將離心柱放入其中，加入洗脫液（AVE）40~60μl，室溫靜置1分鐘后，用8000rpm離心1分鐘回收核酸，以備PCR檢測使用。
1.5、要點提示：
?。?）、新鮮裂解液的配制應盡可能在專門的潔凈區域或單獨的實驗室進行。
?。?）、要用分子生物學級別的無水乙醇試劑進行配制。
（3）、向離心柱中加入裂解產物、洗液時操作要非常小心，盡量將洗頭下探到離心柱內部后靠管壁加樣，切忌出現溢灑后污染到離心柱的密封圈，這可能會導致乙醇殘留，抑制后續PCR反應。
?。?）、從離心機中取出離心柱時應小心操作，避免離心柱下緣被收集管中的濾過殘液污染。
?。?）、加入洗液2（AW2）后的第二次空管全速離心非常關鍵，能幫助充分甩離離心柱濾膜中殘留的洗液2殘液，確保洗脫核酸的純度。
?。?）、洗脫液加樣時需小心操作，確保洗脫液盡可能覆蓋全部離心柱濾膜，充分洗脫核酸，提高核酸提取的產量。
（7）、手工核酸提取可優選使用檢測試劑盒說明書推薦的配套手工提取試劑，也可選用通用手工提取試劑。
?。?）、樣本處理過程中，工作人員覺得有必要時，應隨時更換新的外層乳膠手套。
2、采用核酸提取儀提取核酸的操作流程
根據核酸提取儀和試劑的說明書準備好提取試劑，取200μl樣本上機提取核酸，并按照要求回收提取好的核酸備用。
要點提示：
1、不同的提取儀器和試劑的提取效率可能存在差異，請一定嚴格按照提取試劑盒的說明書進行核酸提取操作。
2、有條件時可以考慮配備小型化的核酸提取儀在安全柜內使用，以進一步加強生物安全防護；若使用在安全柜外的核酸提取儀，則一定要做好生物安全防護及樣本的防污染保護。
四、PCR體系的配制和模板加樣
1、操作流程：
在基因擴增實驗室的試劑配制區或單獨的實驗室，配制PCR體系。根據試劑盒說明書的要求，將試劑盒的不同組分（一般包括反應液、酶、引物等）按照各自必須的體積量進行配制混合，充分混勻并離心后，通過傳遞窗傳遞到核酸提取和加樣區，或由專人從試劑配制實驗室送至核酸提取和加樣實驗室。在加樣生物安全柜內，根據檢測樣本例數分裝體系到每個反應管中，逐一將樣本核酸加入到對應的反應管中，并加蓋密閉好PCR反應管；每批次檢測需要做一個陽性對照和3個陰性對照。
2、要點提示：
?。?）、試劑配制必須嚴格在試劑配制區或單獨、潔凈的實驗室和安全柜內進行，以確保試劑不會有被污染的可能。
（2）、試劑配制時要根據檢測樣本數量進行合理配制，每批次檢測均需要包括3個陰性對照和1個陽性對照的試劑，同時還需要考慮試劑分配過程中的正常損耗等消耗。
?。?）、加樣可以和樣本處理/核酸提取在同一分區或同一間實驗室進行，但如有條件好在單獨的加樣區或至少使用安全柜進行加樣。
?。?）、體系分裝建議每次更換新的吸頭，避免反復使用帶來體積誤差和交叉污染。
?。?）、應配置體系加樣登記表，確保加樣過程準確無誤。
?。?）、PCR密閉管蓋應特別謹慎，建議更換新的手套，防止手套等接觸管蓋內部帶入污染的風險。
五、上機檢測及結果分析
1、操作流程：
在擴增區或擴增實驗室，由專人取出配制好的PCR檢測管，混勻、離心后，小心上機檢測，按照試劑盒說明書設置擴增參數并分析判讀結果。進行結果分析時，應認真閱讀試劑盒說明書，在了解該試劑盒的靈敏度、檢測方法和局限性等技術特點的基礎上，結合該批次陰性質控的結果，綜合判讀樣本的檢測結果。檢測結束后，為防止可能的擴增污染，擴增結束后的PCR管嚴禁開蓋或帶離擴增實驗室，應盡快通過可密封塑料袋等容器盛裝密閉后，放入醫療垃圾桶中做進一步處理。
2、要點提示：
?。?）、因基因擴增區存在污染的風險，應設專門的擴增區域或在單獨的實驗室進行擴增，必須和核酸提取、試劑配制區域有嚴格的物理分割。
?。?）、不同操作區域的工作服不要混穿，特別是基因擴增區的工作服，建議僅在擴增區域或擴增實驗室內使用。
?。?）、熟悉檢測用PCR儀器的基本性能和特點，能客觀分析判斷檢測結果。
六、檢測后的消毒處理
1、操作流程：
?。?）、生物安全柜內：在完成樣本核酸提取后，應在安全柜內用75%消毒酒精對外層手套進行消毒處理，并將外層手套取下后棄至安全柜內的垃圾桶中。小心收納并丟棄使用過的一次性吸水臺布，用0、5%~1%的有效氯消毒劑或75%酒精擦拭安全柜臺面、移液器等安全柜內全部儀器的表面。將安全柜內產生的新型冠狀病毒相關醫療垃圾經3層包裝后，轉移至實驗室的醫療垃圾桶中。開啟紫外燈照射生物安全柜，時間應大于30分鐘。
?。?）、樣本核酸提取工作人員實驗室內：他人協助用0、5%~1%的有效氯消毒劑或75%酒精均勻噴灑內層手套、袖口、手臂及隔離衣后，將外層反穿隔離衣脫下至新型冠狀病毒醫療垃圾桶中送高壓處理。
（3）、樣本處理實驗室內：用0、5%~1%的有效氯消毒劑或75%酒精消毒實驗室臺面和地面；開紫外燈進行大于30分鐘的空間消毒。
?。?）、工作人員摘脫三級防護：在緩沖區戴新的外層手套，摘護目鏡置于75%酒精浸泡消毒，從頭開始，自上而下、由內而外緩慢翻轉脫下一次性防護服，直到將一次性防水靴套全部脫下，將防護服置于新型冠狀病毒醫療垃圾桶中送高壓處理。摘口罩、帽子、內層鞋套和內層手套后同樣置于新型冠狀病毒醫療垃圾桶中送高壓處理。
?。?）、新型冠狀病毒相關醫療垃圾：所有新型冠狀病毒相關醫療垃圾均需經濕熱高壓滅菌后再作為普通醫療垃圾處理，且垃圾袋上應標注新型冠狀病毒醫療垃圾的相關信息。高壓處理前后的垃圾要嚴格區分，在高壓滅菌區域對新型冠狀病毒醫療垃圾進行濕熱高壓滅菌處理，高壓參數為121℃、30分鐘。高壓要做物理、生物指示，以確保高壓滅菌的效果。
2、要點提示：
?。?）、生物安全柜內是風險高區域，操作者的外層手套經消毒后必須脫在安全柜內。
?。?）、靴套或鞋套的主要作用是對操作者的腳和腿部進行防護，要求必須防水，以確保在實驗室內發生意外遺灑時可隔離污染。
（3）、核酸提取儀內部、生物安全柜內部和實驗室空間均應進行紫外線消毒，但紫外線對空氣的消毒效果好，對物體表面的消毒效果隨距離變遠而減弱，故在紫外線消毒前，仍需對各種儀器表面、臺面、地面用消毒劑進行擦拭消毒。
?。?）、工作人員在摘脫個人三級防護后，仍應參照實驗室原有實驗后操作流程進行嚴格認真的常規消毒處理，特別是實驗后的手衛生環節。
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